伊人久久丁香色婷婷啪啪丨欧美日韩国产一区二区三区不卡丨亚洲欭美日韩颜射在线丨国产成人福利美女观看视频丨久久国产精品波多野结衣av

　　免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。傳統實驗方法用小玻片，先泡酸、再晾干、再 coating、再種細胞、染色、封片成像。

　　本文章介紹新方法，我們將描述在通道載玻片內培養大鼠成纖維細胞（Rat1）的單個實驗案例。然后，我們用AlexaFluor®488鬼筆環肽染色F-肌動蛋白細胞骨架，并用DAPI對細胞核進行復染。

　　該實驗包括四個主要步驟：

　　實驗所需材料：

　　• HT1080細胞懸浮液（180μl；3x10⁵ 細胞/ml）

　　• 具有10% FCS的DMEM

　　• μ-Slide VI^0.4，ibiTreat底部處理（ibidi #80606）

　　• Dulbecco′s PBS

　　• PBS中3.7%多聚甲醛（PFA）

　　• 0.1% Triton® X-100

　　• PBS中的1% BSA

　　• Alexa Fluor® 488鬼筆苷（0.165 μM）

　　• DAPI（0.1 μg/ml）

　　• ibidi封片劑（ibidi #50001）

　　• 可選：ibidi浸漬油（ibidi #50101）

　　1、培養

　　• 在無菌條件下打開 μ-Slide VI ^0.4、ibiTreat (80606) 的包裝，并將其放在 μ-Slide 架 (80003) 上。

　　• 在每個通道中加入 30 μl 3x10⁵細胞/ml 大鼠成纖維細胞（Rat1）細胞懸液。如下圖所示或我們的網站上所示，直接將移液器加入通道。

　　• 用隨附的蓋子蓋住。

　　• 將載玻片放入培養箱 (37 °C; 5% CO2) 培養并讓細胞附著 (60 分鐘)。然后用 60 μl 無細胞培養基填充兩個通道口。

　　• 孵育過夜。

　　2、固定和透化

　　在固定和透化過程中要小心，通道永遠不要變干！通過用下一個沖洗剩余的溶液來交換通道中的液體

　　固定：

　　• 使用細胞培養抽吸裝置從所有通道口中吸出培養基。用 Dulbecco PBS 洗滌細胞，方法是將 200 μl 緩慢加入每個通道的一個空通道口，并從每個通道的相對通道口吸出。不要吸出整個通道體積。

　　• 用約 100 μl 3.7% 多聚甲醛的 PBS 固定細胞。20 分鐘后，通過用 200 μl PBS 填充一孔并從另一孔中吸出來沖洗通道內的液體；確保通道永不干涸。

　　透化和封閉：

　　• 如上所述，用 200 μl PBS 再次洗滌細胞。

　　• 在 PBS 中用 ~100 μl 0.1% Triton® X-100 3-5 分鐘。

　　• 用 PBS 洗滌細胞。

　　• 用 ~100 μl 封閉溶液（PBS 中的 1% BSA）20 分鐘。

　　• 用 PBS 洗滌細胞。

　　3、染色

　　• 使用抽吸裝置從通道中取出所有液體。不要讓通道變干。

　　• 吸液后立即加入 30 μl Alexa Fluor® 488 鬼筆環肽（在 200 μl PBS 和 1% BSA 中）。用 1 毫升注射器注射溶液會有所幫助。在室溫下孵育 20 分鐘。

　　• 用 PBS 洗滌細胞。

　　• 用 30 μl DAPI (0.1 μg/ml) 3-5 分鐘。

　　• 用 PBS 清洗細胞并應用 ibidi 封固培養基，直到通道被填滿（約 50 μl）。ibidi 封固劑以甘油為基礎，并含有用于抗褪色的 DABCO。載玻片可存放約4 周。

　　4、成像

　　在熒光顯微鏡下選擇適當的濾鏡，也可以使用浸油觀察細胞。

　　之所能如此簡便完成免疫熒光實驗，是因為這些ibidi培養皿和載玻片的底部為特殊處理的材質，絕大多數細胞可以直接貼壁生長，而不需要另外包被。同時，這些耗材的底部薄如蓋玻片，可以直接使用倒置顯微鏡進行觀察，得到高質量的成像，適用于顯微鏡比如共聚焦顯微鏡。

　　實驗例子

　　超分辨率顯微鏡 (STED)觀察肌動蛋白細胞骨架

　　μ-Slide VI ^0.4與超分辨率顯微鏡方法兼容，使用 LifeAct-TagGFP2 蛋白，可以詳細觀察肌動蛋白細胞骨架。在這個實驗中，固定的 Rat1 成纖維細胞與 LifeAct-TagGFP2 蛋白一起在 μ-Slide VI ^0.4，ibiTreat中孵育。并用 STED 顯微鏡以創建超分辨率圖像。

　　使用LifeAct-TagGFP2 蛋白對 Rat1 成纖維細胞中的肌動蛋白細胞骨架進行超分辨率顯微鏡檢查。使用 Plan-Neofluar 100x/1.4 物鏡在 STEDYCON 超分辨率 STED 納米顯微鏡系統（Abberior Instruments GmbH，德國哥廷根）上進行顯微鏡檢查。

　　μ-Slide VI ^0.4用于獲取人 BJ 成纖維細胞的共聚焦圖像。用 Drp-1 siRNA 轉染細胞并用 MitoTracker Red 染色以觀察融合的線粒體。

　　在 ibidi μ-Slide VI ^0.4中培養的人 BJ 成纖維細胞的共聚焦顯微鏡圖像。MitoTracker Red（紅色）用于可視化線粒體。圖片由土耳其伊斯坦布爾哈里克大學醫學院的 Fulya Dal Yontem 提供。

　　用于肌動蛋白可視化的熒光顯微鏡

　　在這個例子中，A549 細胞（肺泡上皮細胞）在 μ-Slide VI ^0.4，ibiTreat上培養，以研究促炎刺激對細胞骨架重排的影響。將細胞暴露于內毒素 (LPS) 中 4 小時，并用熒光鬼筆環肽染色以觀察細胞收縮和細胞間間隙的出現。

　　A549 細胞在 μ-Slide VI ^0.4、ibiTreat 上生長，暴露于內毒素 (LPS) 4 小時，并用熒光鬼筆環肽染色以檢測細胞肌動蛋白（紅色）。40 倍放大倍率。圖片由美國弗吉尼亞州里士滿弗吉尼亞聯邦大學的 Bernard Fisher 提供。