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　　不同細(xì)胞類型的細(xì)胞接種密度特征（見第 4.1.2 節(jié)）

　　1.介紹

血管生成實(shí)驗(yàn)是篩選物質(zhì)以發(fā)現(xiàn)它們對培養(yǎng)細(xì)胞的抗或促血管生成作用的有力工具。通過比較用物質(zhì)處理的細(xì)胞與對照細(xì)胞培養(yǎng)物，物質(zhì)的效果可以通過管長和凝膠（即 MatrigelTM值）表面形成的環(huán)數(shù)等參數(shù)來衡量。

進(jìn)行血管生成分析需要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案并建立提供可靠數(shù)據(jù)采集方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)置的三個(gè)關(guān)鍵組成部分是數(shù)據(jù)采集時(shí)間點(diǎn)、細(xì)胞接種密度和細(xì)胞培養(yǎng)基的血清濃度。

本應(yīng)用將幫助使用您自己的細(xì)胞系優(yōu)化試管形成分析的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，確保可靠的數(shù)據(jù)采集和可重現(xiàn)的結(jié)果。

在本應(yīng)用簡報(bào)的某些部分，我們討論了ibidi µ-Slide 血管生成，但在任何容器中進(jìn)行的管形成分析都將顯示相同的特征，并且可以以相同的方式處理數(shù)據(jù)。

µ-Slide 血管生成載玻片

　　2.選擇正確實(shí)驗(yàn)方案

進(jìn)行血管形成分析的第一步是確定實(shí)驗(yàn)方案。三個(gè)最重要的考慮因素是：

· 細(xì)胞類型——內(nèi)皮細(xì)胞中生理性地觀察到管形成

· 凝膠基質(zhì)——它需要與細(xì)胞相容，并且必須為細(xì)胞附著提供結(jié)合基序

· 培養(yǎng)基成分（要求生長因子？）

適用于大多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞的設(shè)置包括MatrigelTM、減少生長因子和含 2% 或更少血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。

　　3.數(shù)據(jù)分析概述

為了更好地理解優(yōu)化的后續(xù)步驟，需要對數(shù)據(jù)分析參數(shù)進(jìn)行概述。

如下圖所示的顯微圖像顯示了具有四個(gè)可檢測關(guān)鍵參數(shù)管狀網(wǎng)絡(luò)：

· 細(xì)胞覆蓋區(qū)域（藍(lán)色）

· 管（紅色）

· 循環(huán)（黃色）

· 分支點(diǎn)（白色）

可以從這些參數(shù)計(jì)算其他值，例如平均管長度、總管長度和平均環(huán)路面積。

圖1，管形成分析的關(guān)鍵指標(biāo)

有幾種方法可以執(zhí)行圖像分析。一種方法是使用圖像處理軟件手動執(zhí)行此操作，例如 ImageJ“血管生成分析器”。

另一種選擇是使用自動圖像分析平臺，例如ACAS.

　4.實(shí)驗(yàn)前工作

在開始篩選實(shí)驗(yàn)之前，必要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)程序和設(shè)置。
　　
4.1. 實(shí)驗(yàn)裝置的優(yōu)化

細(xì)胞接種密度、數(shù)據(jù)采集時(shí)間點(diǎn)和血清濃度對數(shù)據(jù)值有很大影響。因此，創(chuàng)建嚴(yán)格對于生成可重復(fù)的數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)集之間的可比性至關(guān)重要。

　　4.1.1. 測量時(shí)間間隔

首先，選擇細(xì)胞濃度和促進(jìn)血管形成的設(shè)置來記錄時(shí)間曲線。對于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC) 每孔約 10,000 個(gè)細(xì)胞，使用具有減少生長因子的基質(zhì)膠TM值和不含血清或生長因子的細(xì)胞培養(yǎng)基就足夠了。

接下來，按照應(yīng)用說明制備凝膠和細(xì)胞懸液，“ibidi µ-Slide 血管生成的形成分析”。在凝膠表面播種細(xì)胞后，立即將載玻片放入顯微鏡的培養(yǎng)室中，并開始延時(shí)記錄。每 10 分鐘記錄一張圖像，使用基于軟件的工具在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)調(diào)整焦點(diǎn)?；蛘?，如果您的顯微鏡上沒有孵化室，則每小時(shí)記錄一次圖像，至少在前 8 - 10 小時(shí)內(nèi)。記錄每個(gè)圖像后立即將樣品放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在過夜培養(yǎng)后記錄最終圖像。

最后，分析圖像并使用合適的軟件可視化曲線。參數(shù)（例如，總管長）的時(shí)間曲線通常如下圖所示。曲線上升到最大值（約 5 小時(shí)），然后下降到平均期（約 7 小時(shí)開始），然后慢慢變平（> 20 小時(shí)）。由于所有四個(gè)關(guān)鍵參數(shù)的特征看起來相似，只評估一個(gè)參數(shù)就足夠了。我們選擇管總長度作為參數(shù)，因?yàn)樵紙D像提供了一個(gè)控制，可以輕松地與評估圖像進(jìn)行比較。

圖2，24小時(shí)內(nèi)管長的時(shí)間響應(yīng)

最佳結(jié)果出現(xiàn)在最大階段以及不會迅速下降的穩(wěn)定階段。在上例中，4 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)和 10 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)是很好的測量參考點(diǎn)。

　　4.1.2. 細(xì)胞接種密度

要確定最佳細(xì)胞接種密度，請記錄細(xì)胞系的特征。

首先，在 5-40 x 10 3cells/ml 范圍內(nèi)進(jìn)行一系列稀釋，然后將細(xì)胞接種到凝膠表面。按照第 4.1.1 節(jié)中的說明將樣品孵育確定的時(shí)間長度，并記錄相襯圖像。每個(gè)細(xì)胞濃度執(zhí)行五次重復(fù)。

評估圖像，分別在第 3 節(jié)和第 5 節(jié)中提到。將數(shù)據(jù)可視化為圖表，如下所示。數(shù)據(jù)將顯示具有最大值的特性曲線。該最大值是您的細(xì)胞類型的最佳接種密度。

圖3，HUVEC 和 EA.hy926接種4小時(shí)后的密度響應(yīng)

4.1.3. 血清濃度

向培養(yǎng)基中添加血清可能會影響試管形成行為。在大多數(shù)情況下，血清抑制管形成。為避免此問題，請使用您在第 4.1.1 節(jié)和第 4.1.2 節(jié)中確定的條件測試不同的血清濃度，范圍為 0 - 20%。這將確定哪種血清濃度最適合血管生成和細(xì)胞存活。

　　4.1.4. 放大倍數(shù)

放大倍數(shù)決定了能夠被相機(jī)成像的孔區(qū)域。由于管的形成發(fā)生在孔的整個(gè)表面區(qū)域，重要的是盡可能地對最寬的部分進(jìn)行成像。如果不需要檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)節(jié)，請使用低倍率（4 倍或 5 倍）。如果需要檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)節(jié)，建議對每個(gè)孔拍攝幾張放大倍數(shù)更高的圖像并將它們拼接在一起

　4.2. 建立陽性和陰性對照

要創(chuàng)建陽性對照，請選擇確保血管形成的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（例如，具有減少生長因子的基質(zhì)膠TM值和用于 HUVEC 的無血清培養(yǎng)基）。陽性對照確保細(xì)胞是健康的，并且觀察到的任何抗血管生成作用都是由所研究的物質(zhì)引起的。

要創(chuàng)建陰性對照，請選擇一種經(jīng)證實(shí)對血管形成發(fā)展具有抑制作用的物質(zhì)（例如，用于 HUVEC 的蘇拉胺）。陰性對照確?？梢砸种萍?xì)胞中的管形成，并為您的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供一個(gè)比較點(diǎn)。

4.3. 實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和重復(fù)次數(shù)

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，計(jì)算所需材料的數(shù)量，例如細(xì)胞、培養(yǎng)基、凝膠基質(zhì)和物質(zhì)。還要計(jì)算實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和空間要求以及時(shí)間表。

為了正確地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建議至少進(jìn)行四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少有 8 個(gè)單孔。所需的實(shí)驗(yàn)次數(shù)取決于數(shù)據(jù)的均勻性。遵循嚴(yán)格的協(xié)議對于數(shù)據(jù)采集至關(guān)重要。

對數(shù)據(jù)集執(zhí)行學(xué)生 T 檢驗(yàn)。p 值 ≤ 0.05* (≤ 0.01**) 表示該模型有足夠的功效，無需額外實(shí)驗(yàn)即可繼續(xù)。

　　4.4. 文檔

合理的文檔包括本節(jié)中確定的所有參數(shù)。生成一個(gè)表格圖表，其中每個(gè)實(shí)驗(yàn)都記錄在一列中。附錄中給出了一個(gè)例子。

　　5.數(shù)據(jù)分析

每個(gè)分析孔生成一個(gè)管長度值。然后將一個(gè)實(shí)驗(yàn)（每個(gè)條件至少 8 個(gè)孔）的值相加并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于 10%。這只是一個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)?！?/p>

左圖顯示了在四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，一種實(shí)驗(yàn)條件下單孔結(jié)果的分布。右圖顯示了一種實(shí)驗(yàn)條件在四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的平均結(jié)果。

為了正確穩(wěn)定的統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)條件至少需要四個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。請記住，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)由 8 個(gè)單獨(dú)的孔組成。

單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)合并為一個(gè)平均值，并可以顯示在條形圖中。統(tǒng)計(jì)分析是通過學(xué)生 T 檢驗(yàn)完成的，其中對不同的數(shù)據(jù)點(diǎn)群體進(jìn)行相互檢驗(yàn)。

　　
6.數(shù)據(jù)解讀

學(xué)生的 T 檢驗(yàn)提供了兩個(gè)單獨(dú)的數(shù)據(jù)集是否具有 t 分布值的證據(jù)，表明彼此之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。實(shí)驗(yàn)中的重復(fù)次數(shù)和實(shí)驗(yàn)次數(shù)會影響分析。學(xué)生 T 檢驗(yàn)可以使用統(tǒng)計(jì)分析軟件（即 SAS）或 Microsoft® Excel® 進(jìn)行。

重要的是要考慮可以使用管形成數(shù)據(jù)實(shí)際預(yù)測的內(nèi)容。管的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，它結(jié)合了各種各樣的生化反應(yīng)和途徑。我們認(rèn)為，該實(shí)驗(yàn)裝置適用于篩選物質(zhì)并提供有關(guān)物質(zhì)抗促血管生成作用的初步預(yù)測。它沒有解釋任何觀察到的效果是如何工作的。需要額外的生化分析來確定這一點(diǎn)。